jueves, 11 de diciembre de 2014

DESCRIPCIÓN Y UTILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.
Son los más corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos, sí son los más conocidos en un laboratorio de Microbiología.
Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de gérmenes que no presentan exigencias particulares. No es diferencial.
 


 
Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza además para la investigación de los diversos tipos de hemólisis(α, ß ó gamma ). Se utiliza para el crecimiento de estreptococos. Para la preparación del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sódico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el tripticase de soja. La adición de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que están en el interior de los hematíes, pero sí puede añadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolábiles.La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolíticas o contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de determinados gérmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razón el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y Haemophilus, pero en él pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El agar chocolate puede convertirse quizás en uno de los medios más enriquecidos si añadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente según las casas comerciales (Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen más de una docena de compuestos que confieren a este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adición de uno o varios antibióticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de determinados microorganismos. Un ejemplo clásico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha añadido unamezcla de tres antibióticos específicos que impedirán el crecimiento del resto de la flora acompañante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado para el aislamiento e identificación de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los gérmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composición lleva un azúcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los gérmenes que fermenten la lactosa producen una acidificación del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas serán incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).

 
Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrólito Deficiente) está recomendado para el recuento e identificación presuntiva de los microorganismos de las vías urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasión de los cultivos por Proteus.La presencia de lactosa en su composición le confiere el carácter de medio diferencial, aunque la interpretación sea diferente al anterior medio por la incorporación de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecerán de color amarillo y las lactosa negativas lo harán con un color verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y Shigella a partir demuestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y gérmenes Gram positivos. La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS es doblemente diferencial, porque además de indicarnos el comportamiento de los gérmenes con relación a la lactosa, nos muestra los gérmenes que son capaces de producir ácido sulfhídrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el centro de la colonia. Así, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de Salmonella, y será exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas bioquímicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razón debe utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen :Es un medio más diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azúcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio es capaz de detectar los gérmenes formadores de SH2, igual que el SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azúcares, que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos gérmenes de cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obteniéndose colonias más numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La inhibición tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que señalar que el vibrión colérico crece bien en este medio.
 
Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realización de los antibiogramas o pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos.
 





MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación. Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.
Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que necesitan un medio que contenga células vivas.
 

Según sus cualidades físicas, se distinguen
  • líquidos
  • semisólidos
  • sólidos
CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:
a) Su consistencia
b) Su utilización
c) Su composición
d) Su origen

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. Agar-agar: Es un polímero de azúcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molécula insoluble enagua pero soluble en agua caliente; una solución al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39ºC y nose funde por debajo de 85ºC. Funde a 90ºC y solidifica una vez fundido alrededor de los 45ºC. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgánicos indefinidos que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacáridos, Araki, en 1937, los dividió en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de ácido pirúvico, y- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporción de agarosa a agaropectina en el agar varía según el alga de origen. El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los más importantes son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriológico, agares purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiológico, por lo que es importante la ausencia de metales tóxicos.
 
3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias.

 

 

ESCHERICHIA COLI


Escherichia coli (E. coli) es una bacteria que se encuentra normalmente en el intestino del ser humano y de los animales de sangre caliente. La mayoría de las cepas de E. coli son inofensivas. Sin embargo algunas de ellas, como E. coli enterohemorrágica (EHEC), pueden causar graves enfermedades a través de los alimentos. La bacteria se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne picada cruda o poco cocida, leche cruda, y hortalizas y semillas germinadas crudas contaminadas.
Su importancia como problema de salud pública se hizo patente en 1982, después de un brote registrado en los Estados Unidos de América. EHEC produce toxinas, conocidas como verotoxinas o toxinas de Shiga por su semejanza con las toxinas producidas por Shigella dysenteriae. EHEC puede crecer a temperaturas que oscilan entre 7 °C y 50 °C, con una temperatura óptima de 37 ºC. Algunas EHEC pueden proliferar en alimentos ácidos, hasta a un pH de 4,4, y en alimentos con una actividad de agua (Aw) mínima de 0,95. Se destruye cociendo los alimentos hasta que todas las partes alcancen una temperatura de 70 °C o más. E. coli O157: H7 es el serotipo de EHEC más importante por su impacto en la salud pública, pero hay también otros serotipos frecuentemente implicados en brotes y casos esporádicos.




Síntomas

Entre los síntomas de la enfermedad causada por EHEC destacan los calambres abdominales y la diarrea, que puede progresar en algunos casos a diarrea sanguinolenta (colitis hemorrágica). También puede haber fiebre y vómitos. El periodo de incubación varía entre tres y ocho días, con una mediana de tres a cuatro días. La mayoría de los pacientes se recuperan en el término de 10 días, pero en un pequeño porcentaje de los casos (especialmente niños pequeños y ancianos) la infección puede conducir a una enfermedad potencialmente mortal, como el síndrome hemolítico urémico (SHU).

El SHU se caracteriza por una insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica y trombocitopenia. Se estima que hasta un 10% de los pacientes con infección por EHEC pueden desarrollar síndrome hemolítico urémico, con una tasa de letalidad de 3%-5%. Globalmente, el SHU es la causa más común de insuficiencia renal aguda en los niños de corta edad. Pueden aparecer también complicaciones neurológicas (como convulsiones, accidente cerebrovascular y coma) en el 25% de los pacientes con SHU, así como secuelas renales crónicas, generalmente leves, en aproximadamente un 50% de los supervivientes.
Las personas que sufren diarrea sanguinolenta o calambres abdominales intensos deben buscar atención médica. Los antibióticos no deben formar parte del tratamiento de los pacientes con enfermedad por EHEC, y posiblemente aumentan el riesgo de SHU posteriormente.

Fuentes y transmisión

La mayor parte de la información disponible sobre EHEC guarda relación con el serotipo O157: H7, pues es el más fácil de distinguir bioquímicamente de otras cepas de E. coli. El reservorio de este patógeno es principalmente el ganado bovino. También se consideran reservorios importantes otros rumiantes, como ovejas, cabras y ciervos, y se ha detectado ocasionalmente la infección en otros mamíferos (cerdos, caballos, conejos, perros, gatos) y aves (pollos y pavos).
E. coli O157: H7 se transmite al hombre principalmente por el consumo de alimentos contaminados, como productos de carne picada cruda o poco cocida y leche cruda. La contaminación fecal del agua y de otros alimentos, así como la contaminación cruzada durante la preparación de estos (con carne de vacuno y otros productos cárnicos, superficies y utensilios de cocina contaminados), también es causa de infecciones. Ejemplos de alimentos implicados en brotes de E. coli O157: H7 son las hamburguesas poco cocidas, el salami curado, la sidra fresca no pasteurizada, el yogur y el queso elaborado con leche cruda.
Un número creciente de brotes se asocian al consumo de frutas y verduras (coles de Bruselas, espinacas, lechuga, ensaladas de col y de otro tipo) contaminadas por el contacto con las heces de animales domésticos o salvajes en algún momento durante su cultivo o manipulación. También se ha aislado EHEC en masas de agua (estanques, arroyos), pozos y abrevaderos, y se ha observado que puede sobrevivir durante meses en el estiércol y en los sedimentos de recipientes de agua. Se ha informado de casos de transmisión por el agua, tanto por agua de bebida contaminada como por aguas de recreo.







Los contactos de persona a persona son una forma de transmisión importante por vía oral-fecal. Se ha informado de un estado de portador asintomático, en el que la persona no muestra signos clínicos de la enfermedad pero puede infectar a otros. La excreción de EHEC dura aproximadamente una semana o menos en los adultos, pero puede prolongarse más en los niños. Se ha observado que otro factor de riesgo importante de infección por EHEC son las visitas a granjas y otros lugares donde el público en general puede entrar en contacto directo con el ganado.

Prevención

Para prevenir la infección hay que aplicar medidas de control en todas las etapas de la cadena alimentaria, desde la producción agropecuaria en la granja hasta la elaboración, fabricación y preparación de los alimentos en las cocinas tanto de establecimientos comerciales como de los hogares.

Hogares

Las medidas de prevención de la infección por E. coli O157: H7 son similares a las recomendadas para otras enfermedades transmitidas por los alimentos. Las prácticas básicas de buena higiene de los alimentos, descritas en las Cinco claves para la inocuidad de los alimentos (3) que ha establecido la OMS, pueden prevenir la transmisión de los agentes patógenos responsables de muchas enfermedades transmitidas por los alimentos, y también protegen contra las enfermedades de ese tipo causadas por EHEC.
Esas recomendaciones deben aplicarse en todos los casos, en especial la de "Cocine completamente", para que el centro de los alimentos llegue al menos a 70 °C. Hay que lavar bien las frutas y verduras, especialmente si se comen crudas; a ser posible, deberán pelarse. Las poblaciones vulnerables (por ejemplo los niños pequeños y las personas mayores) deben evitar el consumo de productos cárnicos crudos o poco cocidos, leche cruda y productos elaborados con leche cruda.
Se recomienda encarecidamente el lavado frecuente de las manos, sobre todo antes de preparar o consumir alimentos y después de defecar, especialmente en el caso de los cuidadores de niños pequeños, las personas mayores y los inmunodeprimidos, pues la bacteria puede transmitirse de persona a persona, así como a través de los alimentos, el agua y el contacto directo con animales.
Varios casos de infección por EHEC han sido causados por el contacto con aguas de recreo. Así pues, es importante también proteger esas aguas, al igual que las fuentes de agua de bebida, de los desechos animales (4).

Respuesta de la OMS

Ante brotes de E. coli como los registrados en Europa en 2011, la OMS ha respondido:
  • respaldando la coordinación del intercambio de información y la colaboración mediante el Reglamento Sanitario Internacional y la Red Internacional de Autoridades en materia de Inocuidad de los Alimentos (INFOSAN) a nivel mundial;
  • colaborando estrechamente con las autoridades sanitarias nacionales y los asociados internacionales, brindando asistencia técnica y la información más reciente sobre el brote.
En cuanto a la prevención, la OMS ha respondido con una estrategia mundial orientada a reducir la carga de enfermedades de transmisión alimentaria. La OMS ha elaborado el mensaje de las Cinco claves para la inocuidad de los alimentos. Esas cinco claves y el material didáctico asociado proporcionan a los países elementos que es fácil usar, reproducir y adaptar a distintos destinatarios.




 

TINCIONES DIFERENCIALES

Las tinciones diferenciales permiten como su nombre lo dice diferenciar entre los grupos de las bacterias que tienen distintas propiedades tintoriales.
Es decir, las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera mas explicita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones seutilizan para obtener información acerca de la composición de las capas de la pared celular de las células bacterianas.
 
Tinción de Ziehl Neelsen
Técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos. Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to1894), un patólogo. Sinónimos: tinción de Ziehl-Neelsen.
 La tinción de Ziehl-Neelsenes una técnica de tinción diferencial rápida y económica, para la identificación de microorganismos patógenos, por ejemplo
M. tuberculosis
.Fue descrita por primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo y Friedrich Neelsen, un patólogo.

 Fundamento
Las paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se denominan ácido-alcohol resistentes. Las microbacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras.


 
 
Tinción de Gram
 
Es un tipo de tinción   diferencial empleado en bacteriología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana, como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose bacterias gram positivas a las que se visualizan de color morado, y bacterias  gram  negativas a las que se visualizan de color rosa, rojo o grosella.
 
Como los microorganismos contienen más de una proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern y Stearn, los microorganismos grampositivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior a la de los microorganismos gramnegativos; y, a base de sus datos experimentales, deducen las siguientes conclusiones:
  • Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
  • Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
  • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la alcalinidad.
  • Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar la acidez.
  • En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier colorante.
  • Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con otras lipoideas o grasas.
  • La materia grasa extraída de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microorganismos gramnegativos, en que la primera contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la coloración gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
  • El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los microorganismos débilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se vuelve ácida en el curso del desarrollo.
                                                   
 
EN LAS IMAGENES ANTERIORES PODEMOS OBSERVAR LAS BACTERIAS E. COLI Y CLOSTRIDIUM QUE AL SER VISTAS AL MICROSCOPIO DESPUES DE SER TEÑIDAS CON LA TINCION DE GRAM, PODEMOS SABER QUE LA E. COLI ES GRAM NEGATIVA Y LA BACTERIA CLOSTRIDIUM ES GRAM POSITIVA.